PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS IgY ESPECÍFICOS PARA LEISHMANIA AMAZONENSIS

L. F. V. BLANCO, R. P. RIBEIRO, J. E. MENEGHINI, M. MATEUS, M. A. SANTOS, T. L. TEIXEIRA, J. P. SANTOS, C. V. SILVA, A. FERREIRA JUNIOR

Resumo


Os objetivos foram: (i) produzir anticorpos policlonais IgY contra o antígeno total de promastigotas (ATPro) de Leishmania amazonensis; (ii) purificar anticorpos da gema do ovo de galinhas imunizadas; (iii) avaliar a qualidade da purificação; e (iv) diagnosticar as alterações macroscópicas pós-imunização. Três galinhas da linhagem HiSex foram imunizadas com 100 µg de ATPro/250 µL de PBS (pH 7,2) emulsionado em 250 µL de adjuvante completo (imunização primária) e incompleto (2º e 3º booster) de Freund, pela via intramuscular e com intervalo de 14 dias. O volume final (500 µL) foi inoculado em quatro locais do músculo peitoral. Os ovos foram colhidos diariamente e as gemas foram armazenadas a -20ºC. A fração solúvel em água (FSA) foi obtida da gema total, por meio de precipitação em água acidificada (pH 5,0-5,2), seguida de salting-out da FSA com sulfato de sódio (19% e 14%). A purificação foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12% e pelo teste de dot-blot com anticorpos anti-IgY. O diagnóstico das alterações macroscópicas foi realizado durante a necropsia das aves imunizadas, por inspeção do músculo peitoral. Obteve-se um sobrenadante translúcido (FSA) e um precipitado denso de cor amarela. O salting-out da FSA resultou em um precipitado de cor branca (PY). O SDS-PAGE demonstrou a progressiva remoção de contaminantes, a cada etapa da purificação. A fração PY apresentou uma banda proteica de peso molecular estimado de 180 kDa, além disso detectou-se a presença dos anticorpos IgY nesta fração. No músculo peitoral, diagnosticaram-se estruturas encapsuladas drenando, ao corte, líquido amarelado e viscoso. Utilizando metodologia de fácil execução, é produzida uma fração enriquecida em anticorpos IgY com grande potencial de emprego nos estudos celulares para a compreensão da interação de L. amanzonensis e as células hospedeiras. Adjuvantes de Freund produzem, em galinhas, lesões inflamatórias extensas nos locais das imunizações.

PALAVRAS-CHAVE: IMUNOGLOBULINAS. TRIPANOSSOMATÍDEOS. PROTEÔMICA. PATOLOGIA.

AGRADECIMENTO: CNPq e Instituto de Estudos Avançados em Medicina Veterinária José Caetano Borges.

ÁREA TEMÁTICA: Doenças Parasitárias

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DOI: http://dx.doi.org/10.15361/2175-0106.2015v31n2p103