PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS IgY ANTI-P21 RECOMBINANTE DE TRYPANOSOMA CRUZI

R. P. RIBEIRO, E. A. QUADROS, M. TIRONE, M. A. SANTOS, T. L. TEIXEIRA, J. P. SANTOS, C. V. SILVA, A. FERREIRA JUNIOR

Abstract


Os objetivos deste trabalho foram: (i) produzir anticorpos policlonais IgY contra a versão recombinante da proteína de invasão celular P21 (P21r) de Trypanosoma cruzi; (ii) purificar os anticorpos IgY totais da gema do ovo de galinhas imunizadas com P21r; (iii) avaliar a qualidade dos procedimentos de purificação. Para a produção dos anticorpos IgY, três galinhas da linhagem HySex (25 semanas de idade), foram imunizadas com 100µg de P21r /250 µl de PBS (pH 7,2) emulsionado em 250 µl de adjuvante completo (primeira imunização) e incompleto (segunda e terceira imunizações) de Freund. Realizaram-se três imunizações, intramusculares, com intervalo de 14 dias. O volume final (500 µl) foi inoculado em quatro locais do músculo peitoral. Os ovos foram colhidos diariamente, durante sete semanas. As gemas foram armazenadas a -20ºC. Para a purificação, a fração solúvel em água (FSA) foi obtida da gema total, por meio de precipitação em água acidificada (pH 5,0-5,2), seguida de salting-out da FSA com sulfato de sódio (19% e 14%). A extração dos anticorpos IgY foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12% e pelo teste de dot-blot com anticorpos anti-IgY marcados com peroxidase. A água acidificada produziu um sobrenadante translucido (FSA) e um precipitado denso de cor amarela (P1, precipitado 1). O salting-out da FSA resultou em um precipitado de cor branca (P2, precipitado 2). O SDS-PAGE demonstrou a progressiva remoção de contaminantes, a cada etapa da extração. No SDS-PAGE a fração P2 apresentou uma banda proteica de peso molecular estimado de 180 kDa. No dot-blot foi feita a detecção de anticorpos IgY na fração P2. Utilizando procedimentos de fácil execução é produzida uma fração enriquecida em anticorpos IgY com grande potencial de emprego nos estudos celulares envolvendo o papel da P21 na interação parasita-hospedeiro.

PALAVRAS-CHAVE: IMUNOGLOBULINAS. TRIPANOSSOMATÍDEOS. PROTEÔMICA.

AGRADECIMENTO: CNPq e Instituto de Estudos Avançados em Medicina Veterinária José Caetano Borges.

ÁREA TEMÁTICA: Doenças Parasitárias



DOI: http://dx.doi.org/10.15361/2175-0106.2015v31n2p101