PRODUÇÃO DA NUCLEOPROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS DA INFLUENZA AVIÁRIA PARA APLICAÇÃO NO IMUNODIAGNÓSTICO

M. M. BORZI, M. F. S. MONTASSIER, K. R. SILVA, R. M. SANTOS, F. S. FERNANDO, V. C. MARIGUELA, P. D. LOPES, H. J. MONTASSIER

Abstract


A nucleoproteína (NP) do Vírus da Influenza Aviária (VIA) é um importante alvo antigênico no imunodiagnóstico desta doença, devido à sua baixa variabilidade entre as diferentes estirpes virais, resultando em uma elevada reatividade cruzada, e por ser também uma proteína altamente imunogênica para hospedeiros vertebrados. O objetivo deste estudo foi clonar parcialmente o gene codificador da NP do VIA e expressar em Escherichia coli como uma proteína recombinante fusionada ao polipeptídeo SUMO e uma etiqueta de poli-histidina, a fim de utilizá-la no desenvolvimento de um ensaio de ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos contra o VIA. O subtipo H4N6 do VIA tipo A foi propagado em ovos embrionados livres de patógenos e o RNA viral foi extraído. Após a Reação de Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR), foi obtido o material gênico a ser inserido no vetor pET SUMO (Invitrogen®) para posterior transformação em células de E. coli competentes. Foi realizada uma cinética da indução da expressão da NP recombinante (NPr), seguida da caracterização imunoquímica através das técnicas de PAGE-SDS e de Western Blotting, como também análise in silico dos principais sítios de antigenicidade. A NPr foi expressa na fração solúvel e facilmente purificada, sendo utilizada como uma preparação antigênica no ELISA indireto para detecção de anticorpos contra o VIA presentes em 121 amostras de soro de galinha. A análise comparativa do teste desenvolvido em relação ao teste de ELISA comercial apresentou valores de 95%, 97% e 96,7% de sensibilidade, especificidade e acurácia, respectivamente e concordância de 0,88. Os resultados permitem concluir que a NPr do VIA produzida nesse estudo possui características favoráveis para ser aplicada como antígeno no ELISA indireto, o qual se constitui como um método sensível e específico para o imunodiagnóstico da Influenza Aviária em galinhas.

PALAVRAS-CHAVE: CLONAGEM E EXPRESSÃO. PROTEÍNA RECOMBINANTE. ELISA INDIRETO. SORODIAGNÓSTICO.

AGRADECIMENTOS: CNPq.

ÁREA TEMÁTICA: Doenças infecciosas.



DOI: http://dx.doi.org/10.15361/2175-0106.2015v31n2p102