USO DE ANTICORPO POLICLONAL ESPECÍFICO PARA NUCLEOPROTEÍNA RECOMBINANTE DO VÍRUS A BRONQUITE INFECCIOSA (VBI) NA TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA (IHC) PARA DETECÇÃO DE DIFERENTES ESTIRPES DO VBI / USO DE ANTICORPO POLICLONAL ESPECÍFICO PARA NUCLEOPROTEÍNA..

Resumo

Infecção por IBV é uma importante doença que ameaça a indústria de ave em todo o mundo e pode estar envolvida com doenças respiratórias, nefrite e produção de ovos. O diagnóstico convencional do IBV baseia-se no isolamento do vírus em ovos embrionados, seguido de identificação molecular ou imunológica dos isolados, tornando estes procedimentos fastidiosos e demorados. Assim, foi proposto o desenvolvimento do método de IHC para detectar o antígeno de IBV em amostras de tecido, utilizando um soro hiperimune de cabra contra a nucleoproteína recombinante (RN), para a detecção de três diferentes cepas virais de IBV. Uma cabra foi imunizada com proteína N recombinante expressa em Escherichia coli, e depois de cinco imunizações, o soro anti-IBV foi obtido e analisado ​​por ELISA para titulação de anticorpos específicos anti-IBV e Western blot para usar como anticorpo primário, juntamente com o complexo secundário contendo um polímero ligado a peroxidase  usando a técnica IHC para detectar antígenos de IBV nas amostras de tecido. Amostras de tecido traqueal e renal foram coletadas de três grupos de galinhas SPF alojadas em isoladores de pressão positiva; experimentalmente infectadas com as cepas Massachusetts, IBVPR-05 ou IBVPR-12, respectivamente, e o grupo de controle que permaneceu não-infectado. A presença do antígeno de IBV foi detectada no citoplasma das células epiteliais de amostras de traqueia em todos os grupos desafiados, enquanto que as células dos túbulos renais foram marcadas positivamente pela técnica de IHQ em todas as amostras dos grupos desafiados com cepas IBVPR-05-12 e IBVPR, mas não em amostras de rim de aves desafiadas com a cepa Massachusetts. No grupo de controle não foram detectados por IHQ antígenos de IBV em amostras de tecido. Concluindo, a técnica de IHC com o anticorpo policlonal de cabra contra a proteína RN de IBV, foi capaz de detectar especificamente antígenos de IBV em amostras de tecidos de galinhas infectadas com uma estirpe variante e pode ser uma alternativa vantajosa para diagnosticar a infecção direta por IBV, ou mesmo para o método de isolamento de vírus.

SUMMARY

IBV infection has been a major threat to poultry industry worldwide and can be involved in respiratory disease, nephritis and egg production disorders. The conventional diagnosis of the IBV is based on virus isolation in embryonated eggs, followed by molecular or immunological identification of isolates, making these procedures tedious and time consuming. Thus, we proposed the development of IHC method to detect IBV antigen in tissue samples using a goat hyperimmune serum against recombinant nucleoprotein (RN) for detection of three different viral strains of IBV. One goat was immunized with N recombinant protein expressed in Escherichia coli, and after five immunizations, the goat anti-IBV serum was obtained and analyzed by ELISA for titrating anti-IBV specific antibodies and Western blot to use  as a primary antibody, along with the secondary complex containing a polymer linked to peroxidase in the IHC technique to detect IBV antigens in tissue samples. Tracheal and renal tissue samples were collected from three groups of SPF chickens housed in positive pressure isolators;  experimentally infected with a Massachusetts, IBVPR-05 or IBVPR-12 strains, respectively, and from another that remained non-infected (control group). The presence of IBV antigen was detected in the cytoplasm of epithelial cells from tracheal samples in all challenged groups, while kidney tubule cells were positively labeled by IHC technique in all samples from groups challenged with IBVPR-05 and IBVPR-12 strains, but not in kidney samples from birds challenged with Massachusetts strain. No IBV antigens were detected by IHC in tissue samples from the control group. In conclusion, the IHC technique with goat polyclonal antibody against RN protein of IBV, was able to detect specifically IBV antigens in tissue samples of chickens infected with a variant strain and could be an advantageous alternative for the  direct diagnose of IBV infection, or even to the virus isolation method.